การทดสอบ PCR: ความปลอดภัย ขั้นตอน ความสำคัญ

การทดสอบ PCR คืออะไร?

การทดสอบ PCR เป็นวิธีห้องปฏิบัติการที่ใช้ในอณูชีววิทยาและการแพทย์ การทดสอบนี้ใช้สำหรับการตรวจจับและจำแนกลักษณะเฉพาะของสารพันธุกรรมโดยตรง วิธี PCR ได้รับการพิจารณาโดยผู้เชี่ยวชาญว่าใช้งานง่าย นำไปใช้ได้ในระดับสากล และมีประสิทธิภาพ

ในห้องปฏิบัติการ การทดสอบ PCR ประกอบด้วยสองขั้นตอน ในขั้นตอนแรก สารพันธุกรรมที่มีอยู่จะถูกขยายโดยใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) ช่วยให้สามารถตรวจสอบร่องรอยของ DNA ที่เล็กที่สุดได้ นี่เป็นสาเหตุที่การทดสอบ PCR มีการตอบสนองที่ละเอียดอ่อนมาก

ในขั้นตอนที่สอง สารพันธุกรรมจะถูกแยกตามคุณสมบัติของมัน “คัดแยก” และมีลักษณะเฉพาะ กล่าวอีกนัยหนึ่ง คือ การกำหนดโครงสร้างเล็กๆ น้อยๆ ของ DNA

มีวิธีการใช้งานที่เป็นไปได้หลายประการ: แพทย์ใช้การทดสอบ PCR เช่น ตรวจผ้าเช็ดเพื่อดูว่ามีเชื้อไวรัสโคโรนาหรือไม่ การบริจาคเลือดเพื่อหาเชื้อ HIV หรือการคัดกรองทารกแรกเกิดเพื่อหาโรคทางพันธุกรรมที่อาจเกิดขึ้น การติดเชื้อแบคทีเรีย เช่น เชื้อวัณโรค หรือการติดเชื้อปรสิต (มาลาเรีย) สามารถชี้แจงได้โดยใช้ PCR

นอกจากนี้ยังช่วยตัดสินผู้กระทำผิดในสาขาเวชศาสตร์นิติเวชโดยใช้ลายนิ้วมือทางพันธุกรรมหรือใช้เป็นการทดสอบความเป็นบิดา

การทดสอบ PCR ใช้ได้นานแค่ไหน?

โดยทั่วไปผลการทดสอบ PCR จะใช้ได้ภายใน 48 ชั่วโมงนับจากเวลาที่เก็บตัวอย่าง

การทดสอบ PCR มีความน่าเชื่อถือแค่ไหน?

PCR เป็นวิธีการตรวจจับที่ได้รับการทดลองและทดสอบแล้วในการวินิจฉัยระดับโมเลกุลและการแพทย์ ถือได้ว่าเป็นมาตรฐานทองคำที่มีอัตราความผิดพลาดต่ำมาก การทดสอบมีลักษณะพิเศษคือความไวและความจำเพาะที่สูงมาก

ความไวหมายถึงความน่าเชื่อถือในการทดสอบเพื่อค้นหาสารพันธุกรรมที่จะตรวจพบ

ความจำเพาะ หมายถึง ความแน่นอนที่การทดสอบกำหนดว่าไม่มีสารพันธุกรรมที่เป็นปัญหาอยู่ในตัวอย่าง

การทดสอบ PCR จะใช้ได้กับการติดเชื้อ Sars-CoV-2 เมื่อใด

ตามกฎแล้ว การทดสอบ PCR จะตรวจพบการติดเชื้อโคโรนา 20-XNUMX วันก่อนและไม่เกิน XNUMX วันหลังจากเริ่มแสดงอาการ แม้แต่ในผู้ติดเชื้อที่ไม่มีอาการใดๆ เลย การทดสอบยังมีประสิทธิภาพในช่วงเวลาวิกฤตที่อาจทำให้ผู้อื่นแพร่เชื้อได้

ในแต่ละกรณี การตรวจพบสามารถทำได้แม้กระทั่ง 60 วันหลังจากเริ่มแสดงอาการ

แหล่งที่มาของข้อผิดพลาดที่เป็นไปได้

อัตราข้อผิดพลาดในกระบวนการคัดลอก DNA นั้นไม่มีนัยสำคัญในทางปฏิบัติ แม้ว่า DNA polymerase จะไม่ปราศจากข้อผิดพลาด แต่ก็แทบจะไม่มีบทบาทในขั้นตอนการทดสอบ PCR

ในทางปฏิบัติ แหล่งที่มาของข้อผิดพลาดที่อาจเกิดขึ้นนั้นอยู่ในการเก็บตัวอย่างมากกว่า ดังนั้นจึงเป็นเรื่องสำคัญที่ผู้เชี่ยวชาญทางการแพทย์ที่ได้รับการฝึกอบรมจะต้องเช็ดเช็ด ตัวอย่างน้ำลายและน้ำยาบ้วนปากอาจทำให้ความแม่นยำของการทดสอบลดลง เนื่องจากผลของการเจือจางเกิดขึ้นที่นี่

การทดสอบ PCR ทำงานอย่างไร?

ตัวอย่างเช่น การทดสอบ PCR ดำเนินการโดยแพทย์ประจำครอบครัวหรือในศูนย์ทดสอบพิเศษ ขั้นแรก แพทย์หรือผู้เชี่ยวชาญทางการแพทย์ที่ผ่านการฝึกอบรมจะเก็บตัวอย่าง โดยปกติแล้วจะนำผ้าเช็ดทำความสะอาดจากทางเดินหายใจส่วนบนเพื่อทำการทดสอบ ซึ่งมักจะอยู่ในรูปแบบของปากหรือผ้าเช็ดล้างโพรงจมูก

กลั้วคอด้วยน้ำยาล้างก็สามารถทำได้เช่นกัน ตัวอย่างเลือดไม่ปกติสำหรับการตรวจหาโคโรนา แต่มีการใช้กันอย่างแพร่หลายในการตรวจคัดกรองทารกแรกเกิด เป็นต้น

ไม่ว่าตัวอย่างที่นำมาจะเป็นชนิดใดก็ตาม สารพันธุกรรมจะพบอยู่บนสำลี ในสารละลายสำหรับล้าง หรือในหยดเลือด วัสดุตัวอย่างนี้จะถูกส่งไปยังห้องปฏิบัติการ ซึ่งจะถูกแยกและทำให้บริสุทธิ์

การทดสอบ PCR แบ่งออกเป็นสองขั้นตอน:

• PCR: ในขั้นตอนนี้ ปริมาณของสารพันธุกรรมเริ่มต้นจะถูกขยาย

ขั้นตอนที่ 1: PCR - “ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส”

“PCR” เป็นขั้นตอนแรกจากสองขั้นตอน: ซึ่งเป็นขั้นตอนที่ปริมาณ DNA เริ่มต้นที่มีอยู่จะถูกขยาย เนื่องจากสารพันธุกรรมสามารถวิเคราะห์ได้เมื่อมีในปริมาณเพียงพอเท่านั้น ในกรณีส่วนใหญ่ นี่คือดีเอ็นเอของมนุษย์ ในกรณีของการทดสอบโคโรนาไวรัส มันคือ RNA ของไวรัส

PCR ย่อมาจาก "ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส"

สิ่งที่จำเป็นสำหรับ PCR?

DNA เริ่มต้นจะถูกใส่ไว้ในถังปฏิกิริยาที่มีสารพิเศษ สารพันธุกรรมที่มีอยู่ทำหน้าที่เป็นแม่แบบ ซึ่งจะถูกคัดลอกเมื่อมีเอนไซม์บางชนิด (Taq polymerase) และหน่วยการสร้าง DNA พื้นฐานบางตัว

กระบวนการคัดลอกเกิดขึ้นในการดำเนินการซ้ำหลายครั้ง (รอบ)

โดยเฉพาะสารต่อไปนี้จะถูกรวมเข้าด้วยกัน:

• DNA เริ่มต้น: วัสดุตัวอย่างที่จะคัดลอก
• โครงสร้างพื้นฐานของ DNA: เหล่านี้คือนิวคลีโอเบสอะดีนีน, ไทมีน, ไซโตซีนและกัวนีน
• DNA polymerase: เอนไซม์ที่เชื่อมโยงหน่วยการสร้าง DNA แต่ละตัวเพื่อสร้างสาย DNA ที่กำหนดไว้อย่างดี เส้นที่ได้มาใหม่นั้นเป็นภาพสะท้อนในกระจก (เสริม) ของวัสดุตั้งต้นดั้งเดิม
• ไพรเมอร์: ประกอบด้วยคู่เบส 16 ถึง 24 คู่และทำหน้าที่เป็นตำแหน่งเริ่มต้นและสัญญาณเริ่มต้น ไพรเมอร์จะแสดง DNA polymerase ที่ตำแหน่ง (ของ DNA เริ่มต้น) ที่กระบวนการคัดลอกเริ่มต้นขึ้น

การทดสอบ PCR ดำเนินการอย่างไร?

ขณะนี้สารทั้งหมดที่จำเป็นสำหรับ PCR มีอยู่ในถังปฏิกิริยาแล้ว กระบวนการคัดลอกจริงของสารพันธุกรรมจึงสามารถเริ่มต้นได้ การดำเนินการนี้เริ่มต้น ควบคุม และหยุดอีกครั้งตามอุณหภูมิเท่านั้น

ถังปฏิกิริยาจึงได้รับความร้อนหรือเย็นลงตามอุณหภูมิที่แตกต่างกัน ทำได้โดยใช้อุปกรณ์พิเศษที่เรียกว่าเครื่องหมุนเวียนความร้อน ปฏิกิริยาทั้งหมดจะใช้เวลาประมาณหนึ่งถึงสองชั่วโมง

แต่ละขั้นตอนของวงจร PCR มีดังนี้

• การเสียสภาพของ DNA เส้นคู่: ตัวอย่างถูกให้ความร้อนถึงประมาณ 90 องศาเซลเซียส สิ่งนี้จะแยก DNA คู่สายดั้งเดิมออกเป็นสองสายเดี่ยว (เสริม)
• การติดไพรเมอร์: อุณหภูมิจะลดลงเหลือต่ำกว่า 60 องศาเซลเซียสเล็กน้อย สิ่งนี้ทำให้ไพรเมอร์ (ไพรเมอร์ไปข้างหน้า, ไพรเมอร์ย้อนกลับ) ยึดติดกับตำแหน่งที่กำหนดไว้บนสาย DNA แต่ละเส้นที่สอดคล้องกัน

หลังจากรอบการทำงานเสร็จสิ้น อุณหภูมิจะเพิ่มขึ้นอีกครั้งเป็นประมาณ 90 องศาเซลเซียส – รอบการเริ่มใหม่อีกครั้งตั้งแต่ต้น

วิธี PCR สามารถใช้เพื่อขยายลำดับ DNA ได้มากถึงประมาณสามกิโลเบสคู่ (kbp) ซึ่งสอดคล้องกับหน่วยการสร้าง DNA พื้นฐานประมาณ 3,000 หน่วยที่เชื่อมโยงเข้าด้วยกันเพื่อสร้าง "สายโซ่" เพื่อการเปรียบเทียบ: จีโนมมนุษย์จัดเก็บพิมพ์เขียวและข้อมูลการทำงานของเซลล์ไว้ในคู่เบสประมาณสามพันล้านคู่ ในทางกลับกัน จีโนมของไวรัสโคโรนาประกอบด้วยคู่เบส 30,000 คู่ การทดสอบ PCR จึงสามารถขยายและตรวจสอบเฉพาะส่วนสั้น ๆ ของ DNA ทั้งหมดเท่านั้น

ไพรเมอร์มีความสำคัญ

การเลือกไพรเมอร์เป็นสิ่งสำคัญสำหรับขั้นตอน PCR ตัวอย่างเช่น ในการวินิจฉัยโรค Sars-CoV-2 มีการใช้ไพรเมอร์หลายตัว (multiplex PCR)

การทดสอบ Corona PCR จะทำการค้นหายีนไวรัสที่แตกต่างกันสามยีน: ซึ่งจะเพิ่มความจำเพาะโดยรวมเกือบ 99.99% ซึ่งหมายความว่าด้วยอัตราการเข้าชมที่สูงนี้ จะมีการทดสอบผลบวกลวงเพียงหนึ่งครั้งต่อการทดสอบ 10,000 ครั้ง (หากเก็บตัวอย่างอย่างถูกต้อง)

ขณะนี้มีสารพันธุกรรมที่คัดลอกได้จำนวนเท่าใด?

ให้เราสมมติว่ามี DNA double strand ที่เหมือนกันสองเส้นปรากฏอยู่หลังจากรอบแรก

หลังจากแต่ละรอบ ปริมาณของสารพันธุกรรม (คัดลอก) จะเพิ่มเป็นสองเท่า ปริมาณ DNA จึงเพิ่มขึ้นอย่างทวีคูณ

แพทย์มักจะทำซ้ำขั้นตอนนี้ประมาณยี่สิบถึงสามสิบครั้ง

หากพูดโดยนัยแล้ว หมายความว่าแม้ว่าจะพบ DNA double strand เพียงเส้นเดียวในตัวอย่างในตอนเริ่มต้น หลังจากผ่านไป XNUMX รอบ ก็จะมีสำเนาที่เหมือนกันจำนวนหนึ่งล้านสำเนาในถังปฏิกิริยา

ค่า Ct หมายถึงอะไร?

จำนวนรอบการทำงานของ PCR จะแสดงในรูปแบบของค่า Ct ที่เรียกว่า “Ct” มาจากคำภาษาอังกฤษ “cycle Threshold” ค่ากะรัตนี้ทำให้สามารถระบุปริมาณสารพันธุกรรมที่กำลังค้นหาได้

ด้วยค่า Ct ต่ำเพียง 20 จึงมีสารพันธุกรรมเริ่มต้นจำนวนมาก อย่างไรก็ตาม หากค่า Ct สูง (ประมาณ 30 รอบ) ก็จะมี DNA เพียงเล็กน้อยตามลำดับ จึงต้องดำเนินการวงจร PCR บ่อยขึ้น

ขั้นตอนที่ 2: อิเล็กโตรโฟรีซิส “จัดเรียงตามขนาด”

เมื่อมีสารพันธุกรรมที่ "เสริมสมรรถนะ" เพียงพอแล้ว ก็สามารถดำเนินการอิเล็กโตรโฟรีซิสได้ ในกระบวนการนี้ นักวิทยาศาสตร์ใช้ประโยชน์จากคุณสมบัติเฉพาะของ DNA นั่นก็คือประจุไฟฟ้า

โครงสร้างดีเอ็นเอแต่ละส่วนเชื่อมโยงถึงกันผ่านแกนหลักน้ำตาล-ฟอสเฟตที่มีประจุลบ (ลบ) ยิ่งลำดับ DNA ใดลำดับหนึ่งยาวเท่าใด ประจุไฟฟ้าก็จะยิ่งสูงขึ้นเท่านั้น

ช่วยให้สามารถตรวจสอบและจำแนกลักษณะสารพันธุกรรมได้ ในทางปฏิบัติ ตัวอย่างที่ไม่รู้จักมักถูกพล็อตเทียบกับการอ้างอิงที่ทราบบน "เส้นเริ่มต้น" และเปรียบเทียบกันหลังจากช่วงระยะเวลาหนึ่ง

หาก “ความเร็วในการย้าย” เท่ากันสำหรับทั้งสองลำดับ หมายความว่าการตรวจจับมีแนวโน้มเชิงบวกมากที่สุด: การตรวจจับมีแนวโน้มเชิงบวกอย่างมาก – ยีนที่คุณกำลังมองหานั้นมีอยู่ในตัวอย่าง

กรณีพิเศษของไวรัสโคโรนา: การเตรียมตัวอย่างและ RT-PCR

การตรวจหาไวรัสโคโรนาเป็นกรณีพิเศษ Sars-CoV-2 เป็นหนึ่งในไวรัสที่เรียกว่า RNA ซึ่งหมายความว่าสารพันธุกรรม Sars-CoV-2 มีอยู่ในรูปของ RNA (กรดไรโบนิวคลีอิก)

RNA แตกต่างจาก DNA เพียงไม่กี่ประการ เหนือสิ่งอื่นใด มันมีอยู่เป็นเส้นเดี่ยวและมีพื้นฐานมาจากน้ำตาลไรโบสแทนที่จะเป็น 2′-ดีออกซีไรโบส นิวคลีโอเบสไทมีนก็ถูกแทนที่ด้วยยูราซิลเป็นเบสที่สี่

RNA ของไวรัสนี้จะต้อง "คัดลอก" ลงใน DNA ก่อนการทดสอบ PCR ตามปกติ กระบวนการนี้เรียกว่าการถอดรหัสแบบย้อนกลับ (RT) - ด้วยเหตุนี้จึงเรียกว่า RT-PCR ได้รับ cDNA เส้นเดียว (“ดีเอ็นเอเสริม”) ซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของกระบวนการนี้ ในขั้นตอนต่อไป cDNA สายเดี่ยวจะถูกเสริมด้วยสาย DNA ภาพสะท้อนในกระจกเส้นที่สอง

ต้องใช้เวลานานเท่าใดจึงจะได้ผล?

เมื่อส่งตัวอย่างไปที่ห้องปฏิบัติการแล้ว โดยปกติคุณจะได้รับผลภายในหนึ่งหรือสองวันทำการ ในศูนย์ทดสอบซึ่งมักจะตรวจสอบตัวอย่างโดยตรงที่ไซต์งาน อาจใช้เวลาเพียงไม่กี่ชั่วโมงเช่นกัน ช่วงเวลานั้นขึ้นอยู่กับศูนย์ทดสอบและการขนส่งเป็นหลัก

แม้จะมีกระบวนการทำงานที่ซับซ้อน แต่ห้องปฏิบัติการสมัยใหม่ก็สามารถดำเนินการทดสอบ PCR ได้ด้วยปริมาณงานสูง อุปกรณ์อัตโนมัติพิเศษช่วยในการทดสอบ

อย่างไรก็ตาม การทดสอบ PCR ถือว่าค่อนข้าง "ช้า" แต่เป็นวิธีการตรวจจับที่เชื่อถือได้มากกว่า

จะเกิดอะไรขึ้นถ้าผลลัพธ์เป็นบวก?

หากเก็บตัวอย่างอย่างถูกต้อง การทดสอบ PCR เชิงบวกหมายความว่ามีความเป็นไปได้สูงมากที่บุคคลที่ทดสอบจะติดเชื้อ Sars-CoV-2

หากคุณได้รับการยืนยันว่าติดเชื้อไวรัสโคโรนาโดยใช้การทดสอบ PCR หน่วยงานสาธารณสุขจะได้รับแจ้งผลการตรวจเป็นบวกจากห้องปฏิบัติการที่เกี่ยวข้อง ในกรณีเช่นนี้กรมสาธารณสุขจะสั่งกักตัวหรือกักกัน

ฉันจะติดต่อโดยอัตโนมัติหรือไม่หากฉันตรวจพบ PCR ในเชิงบวก

ปกติแล้วใช่ แต่ไม่เสมอไป. ผลการทดสอบ PCR ควรตีความตามบริบทเสมอ การทดสอบเชิงบวกหมายถึงสิ่งแรกและสำคัญที่สุดที่คุณกำลังพกพาสารที่เป็นไวรัส

การทดสอบแอนติบอดีเสริมอาจมีประโยชน์ในบางครั้ง

ในกรณีเช่นนี้ การทดสอบแอนติบอดีจะให้ความมั่นใจที่ยืนยันความถูกต้องของการทดสอบ PCR ทางที่ดีควรปรึกษาเรื่องนี้กับแพทย์ของคุณ พวกเขาสามารถช่วยคุณตีความผลการทดสอบ PCR ได้อย่างถูกต้อง

จะทำอย่างไรถ้าผลลัพธ์เป็นลบ?

ผลการทดสอบ PCR ที่เป็นลบมักหมายความว่าคุณไม่มีเชื้อ Covid-19 ในขณะที่เก็บตัวอย่าง ดังนั้นจึงไม่มีการติดเชื้อในปัจจุบัน อย่างไรก็ตาม คุณอาจอยู่ในช่วงเริ่มต้นของการติดเชื้อ

โดยทั่วไปการติดเชื้อโคโรนาสามารถตรวจพบได้ตั้งแต่วันที่สองหรือสามหลังจากการติดเชื้อเท่านั้น ผลจึงไม่ผ่านฟรี ดังนั้นคุณควรปฏิบัติตามกฎการรักษาระยะห่างทางสังคมและสุขอนามัยต่อไป และสวมหน้ากาก FFP2 ต่อไป เพื่อการปกป้องตัวคุณเองและผู้อื่น

การทดสอบ PCR สำหรับเด็ก

การทดสอบ PCR สำหรับเด็กไม่แตกต่างจากการทดสอบ PCR สำหรับผู้ใหญ่ ทั้งการเก็บตัวอย่างและการตีความผลลัพธ์ใช้ได้ทั้งกับเด็กและผู้ใหญ่

ความเสี่ยงของการทดสอบ PCR คืออะไร?

การทดสอบ PCR ไม่เกี่ยวข้องกับความเสี่ยงทางกายภาพใดๆ เฉพาะการเก็บตัวอย่างด้วยผ้าเช็ดโพรงจมูกเท่านั้นที่บางคนมองว่าน่ากังวลหรือไม่เป็นที่พอใจ

การทดสอบ PCR มีค่าใช้จ่ายเท่าไร?

โปรดทราบ: หากคุณได้ทดสอบตัวเองที่บ้านและได้รับผลลัพธ์เป็นบวก คุณควรนัดหมายกับแพทย์ประจำตัวของคุณทันทีทางโทรศัพท์ แพทย์ของคุณจะหารือเกี่ยวกับขั้นตอนต่อไปกับคุณทางโทรศัพท์

หรือทางที่ดีที่สุดคือโทรไปที่ 116 117 เพื่อลงทะเบียนสำหรับการทดสอบ PCR ตามหลักการแล้ว คุณควรอยู่บ้านจนกว่าจะมีการทดสอบยืนยันเพื่อป้องกันตัวเองและผู้อื่น